生物正交反应是一类能够在生理条件下进行，且不干扰正常生化代谢的连接反应。其极高的选择性（生物正交）且能连接两个反应物的性质使得该反应成为了生物研究中不可或缺的重要方法，最终该反应也成为了2023年诺贝尔化学奖的主题之一。随着该概念以及第一个生物正交反应的提出，越来越多的生物正交反应也在这二十多年间被陆续开发，在这其中，1,2,4,5-四嗪分子与反式环辛烯所发生的逆电子需求的Diels-Alder反应（iEDDA）由于其极快的反应速度脱颖而出，是一类该领域中颠覆性的生物正交反应。然而，由于生物体内广泛存在的亲核性分子，能够与反式环辛烯发生极快生物正交反应的四嗪分子（例如单取代的四嗪分子）往往在生物体内不稳定，甚至失去生物正交的能力。
针对以上目前生物正交反应领域的瓶颈问题，2024年8月20日，北京大学药学院刘涛团队在Journal of the American Chemical Society杂志发表了题为Computational-Guided Discovery of Diazole Monosubstituted Tetrazines as Optimal Bioorthogonal Tools的研究论文。文章利用量子化学计算的方法确定了四嗪分子取代基的关键位阻区域，从而设计并合成出了一系列更小的基于五元二杂环的单取代四嗪分子，从理论和实验层面上证明了其打破了存在于四嗪分子中的反应性/稳定性的限制（图1）。利用这些开发的四嗪分子，在细胞以及动物体内实现了极高效的生物正交反应。
图1 五元二杂环单取代四嗪分子打破了反应性/平衡性的限制
研究内容
1 量子化学计算揭示打破四嗪分子反应性/平衡性的关键因素
单取代四嗪往往反应能力广泛且强，与普通的烯烃都能发生较快的反应，所以单取代四嗪能兼容的官能团很有限。目前绝大部分单取代四嗪的取代基都仅有芳香环或普通烷基构成，然而，刘涛团队通过理论计算发现了这两类最常用的单取代四嗪分子都存在各自的缺陷，最后提出了五元二杂环单取代四嗪分子是潜在的更好的，用于与反式环辛烯（TCO）反应的四嗪分子（图2）。
图2 根据计算提出了元二杂环单取代四嗪分子
2 实验验证五元二杂环单取代四嗪分子是潜在更好的生物正交工具
五元二杂环往往能够与金属离子配位，且容易被强亲核试剂所破坏，造成这类四嗪分子的合成相对困难。为了合成并表征这一系列四嗪分子，研究者们根据已有的四嗪合成路线开发了一种可以实现克级制备相应单取代四嗪分子的合成方法（图3），并且成功合成出了这些五元二杂环的单取代四嗪分子，而后通过实验验证了这些分子具有极高的反应性以及较好的稳定性（图4），其中咪唑类单取代四嗪（红色）的性质尤为突出。
图3 开发的单取代四嗪分子合成方法
图4 实验验证五元二杂环单取代四嗪分子的反应性以及稳定性
3 咪唑单取代四嗪的基因遗传编码以及其在动物水平的用于标记优势的证明
研究者们后续利用基因密码子拓展技术将开发的咪唑单取代四嗪定点引入到了蛋白质上，并且在细胞膜表面实现了二级速率大于10的7次方的标记速度，仅使用1 nM染料在三十秒的情况下就能标记完全。同时也在动物水平证明了该四嗪分子的优势，由于其较高的稳定性和极快的反应速率，咪唑类单取代四嗪在动物体内存在6小时后仍然可以高效地被反式环辛烯染料标记，而其他的常见的“金标准”四嗪分子由于稳定性或者是反应性的问题在动物体内的标记效果都不好（图5）。
图5 四嗪分子在动物水平标记效果的比较
4. 咪唑四嗪类分子可用于蛋白质的高效锚定
治疗蛋白质的锚定往往能解决很多药用蛋白免疫原性、半衰期、全身性毒性的问题。研究者们根据开发的咪唑单取代四嗪在动物体内用于标记的良好效果，将sfGFP、mCherry高效地锚定在了裸鼠的皮下，实现了7天的蛋白质的高效驻留，为后续药用蛋白的锚定策略提供了有力的方法（图6）。
图6 基于咪唑类单取代四嗪的蛋白质锚定策略
该研究开发的新型五元二杂环单取代四嗪是生物正交工具包中十分有利的补充，尤其是其中的咪唑类四嗪分子，既有极高的反应速率，又具有较好的稳定性，使得其可以被遗传编码进入细胞的蛋白组中，成为真核细胞中最快的定点生物正交标签。该四嗪也在动物水平中展现了其强大的反应能力，比以往的“金标准”四嗪分子具有更好的标记效果，从而后续实现了高效的蛋白质锚定技术。
白菜网送彩金（中国）药学院的刘涛教授，南开大学化学院的彭谦教授，中国地质大学的娄筱叮教授为本文的通讯作者。白菜网送彩金（中国）药学院2023级博士研究生李雨轩，2022级博士研究生苏晔宇为本文的共同第一作者，团队成员王浩宇，谢元哲，王昕，常丽颖，景彦博，张佳仪，马军安博士，金宏威博士为该研究做出了重要贡献。该研究获得中国国家重点研发计划、国家自然科学基金、国家科技重大专项计划等项目的支持。
论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c07958
【刘涛教授简介】
刘涛，博士，白菜网送彩金（中国）药学院长聘教授，博士生导师，分子与细胞药理系主任，天然药物及仿生药物国家重点实验室PI，化学生物学交叉中心PI，北大医学-惠大基因密码子创新联合实验室负责人。国家杰出青年基金获得者、国家优秀青年科学基金获得者、国家海外高层次青年人才、北京市杰出青年基金获得者。任中国医药生物技术协会委员合成生物学分会委员，中国生物医学工程学会青工委委员，获中国药学会以岭生物医药青年奖，拜耳教授奖，北大王选青年学者奖等。以通讯作者身份在Nat Chem、Nat Chem Biol、Mol Cell、Sci Adv、JACS、Angew Chem、Chem等国际高水平期刊发表一系列研究论文。担任Journal of Molecular Biology编委，Chinese Chemical Letter编委等。研究集中在蛋白质药物化学修饰，基因编辑与细胞治疗，发展了含有人造氨基酸的蛋白质创新药物，应用在肿瘤及细胞治疗等多种领域，从而促进了生物药物的升级换代。
【彭谦教授简介】
彭谦，博士，南开大学化学学院及元素有机化学国家重点实验室研究员，博士生导师，国家“四青”人才，天津市杰青。2004年中山大学化学系获理学学士学位，2009年中科院上海有机所（导师吴云东院士）获有机化学博士学位。随后在美国University of Notre Dame， Texas A&M University和英国University of Oxford分别进行理论计算化学研究。于2017年在入职南开大学化学学院，已在Acc. Chem. Res., J. Am. Chem. Soc., Nature.Commun.，Angew. Chem. Int. Ed.等国际权威期刊共发表学术论文共60余篇。曾获国家自然科学二等奖，欧盟玛丽居里奖，Thieme Chemistry Journals Award，任《中国化学快报》青年编委。先后主持国家级科研项目6项（含基金委重大项目和重大研究计划课题），省部级项目2项，参与科技部重点研发“催化科学”专项1项。担任Nat.Chem.、Nat.Syn.、Nature.Commun.、JACS等期刊审稿人。
【娄筱叮教授简介】
娄筱叮教授长期以来围绕复杂生物样本，在多功能聚集体设计及应用方面取得了创新性成果。在国际核心期刊上发表/接收SCI论文174篇（高被引论文15篇）。相关研究成果已被国际知名刊物引用9000余次，H因子为57（Google Scholar）。作为第一作者或通讯作者在Chem. Soc. Rev., Acc. Chem. Res., Angew. Chem. Int. Ed.,Adv. Mater., ACS Nano, Adv. Funct. Mater., Nano Energy, Adv. Sci., Anal. Chem., Chem. Sci., Small, Biomaterials, Biosens. Bioelectron. 等国际一流学术刊物发表研究论文112篇，单通讯文章36篇。国家重点研发计划青年项目首席科学家，国家优秀青年科学基金获得者，国家高层次人才特殊支持计划青年拔尖人才，全国青联委员，中青科协理事，湖北省政协委员，湖北省青年五四奖章获得者，湖北省杰出青年基金获得者，湖北省第十二次妇女代表，湖北省青联常委&教育社科界别主委，湖北省知联会理事，湖北省青科协委员，中国生物材料学会影像材料与技术分会委员，《Chinese Chemical Letters》青年编委，湖北省“楚天学者计划”楚天学子。主持国家重点研发计划青年项目1项，国家自然科学基金优青项目1项，面上项目2项，青年项目1项，国家重点研发计划重大科学仪器设备开发专项子课题1项，湖北省自然科学基金杰青项目1项，面上项目1项，浙江省自然科学基金一般项目1项。获得国家授权发明专利12项，参编专著3部。应邀在亚洲化学年会，中国化学会年会，全国分析化学年会，全国化学生物学会议，全国电化学会议，E-MRS，海峡两岸生物医学前沿交叉学术研讨会等国内外会议上做邀请报告。
【第一作者简介】
李雨轩，白菜网送彩金（中国）药学院2023级博士研究生，研究兴趣为生物正交反应的优化与应用；在学期间以第一作者或共同作者身份在J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Nat Comm., Chem., Nat. Chem. Biol..等杂志上发表多篇学术论文。
苏晔宇，白菜网送彩金（中国）药学院2022级博士研究生，研究兴趣为生物正交反应在生物医药领域的应用；在学期间以第一作者或共同作者身份在J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Nat Comm., Chem.等杂志上发表多篇学术论文。
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